A microscopia eletrônica de varredura (MEV) é uma técnica de
obtenção de imagens de alta resolução da superfície de amostras. Na microscopia
eletrônica de varredura a amostra é irradiada por um feixe de elétrons
altamente colimado. Como resultado da interação do feixe de elétrons com a superfície,
uma série de radiações é emitida, i.e.: elétrons secundários, elétrons retroespalhados,
raio-X característico, elétrons Auger, fótons etc. Os sinais de maior interesse
para a técnica SEM são provenientes dos elétrons secundários e dos retroespalhados.
Os elétrons secundários possibilitam a obtenção de imagens da morfologia e
topografia da superfície da amostra em 3D em alta resolução, já os elétrons retroespalhados
são mais indicados para estudos da variação de composição.
O microscópio
O microscópio eletrônico de varredura é constituído,
basicamente, de: (i) uma coluna óptico-eletrônica; (ii) uma unidade de varredura;
(iii) uma câmara de amostras; (iv) um sistema de detecção; (v) um sistema de visualização
e armazenamento da imagem. Na coluna optoeletrônica localizam-se o canhão de
elétrons, que gera os elétrons primários com energia e em quantidade suficiente
para promoverem a excitação da amostra; as lentes condensadoras, as quais
colimam o feixe de elétrons primários; as bobinas eletromagnéticas, que
promovem a deflexão do feixe de elétrons primários no sentido horizontal
(varredura) e vertical (focalização) sobre uma dada região da amostra; as
bobinas eletromagnéticas, as quais fazem as correções de astigmatismo.
No microscópio convencionais, os elétrons são emitidos
termionicamente a partir de um cátodo (filamento) de tungstênio ou hexaboreto
de lantânio (LaB6) e acelerados através de um ânodo, sendo também possível
obter elétrons por efeito de emissão de campo. O tungstênio é tipicamente usado
por ser o metal com mais alto ponto de fusão e mais baixa pressão de vapor,
permitindo que seja aquecido para a emissão de elétrons. O feixe de elétrons, o
qual normalmente têm uma energia que vai desde as algumas centenas de eV até
100keV, é focalizado por uma ou duas lentes condensadoras, em um feixe com um
ponto focal muito fino, com tamanho variando de 0,4 a 0,5 nm. Este feixe passa
através de pares de bobinas de varredura e pares de placas de deflexão na
coluna do microscópio.
Tipicamente as lentes objetivas, as quais defletem o feixe
horizontal e verticalmente para que ele varra uma área retangular da superfície
da amostra. Quando o feixe primário
interage com a amostra, os elétrons perdem energia por dispersão e absorsão em
um volume em forma de gota, conhecido como volume de interação, o qual se
estende de menos de 100 nm até em torno de 5 µm para dentro da superfície da
amostra. O tamanho do volume de interação depende da energia dos elétrons, do
número atômico dos átomos da amostra e da densidade da amostra. A interação
entre o feixe de elétrons e a amostra resulta na emissão de elétrons
secundários, elétrons retroespalhados, elétrons Auger, raios-x Bremstralung,
raios-x característicos, radiação eletromagnética na região do infravermelho,
do visível e do ultravioleta, fônons além de causar aquecimento da amostra.
O microscópio eletrônico de varredura (MEV) é um equipamento
capaz de produzir imagens de alta ampliação (até 1 000.000 x) e resolução. As
imagens fornecidas pelo MEV possuem um caráter virtual, pois o que é
visualizado no monitor do aparelho é a transcodificação da energia emitida
pelos elétrons, ao contrário da radiação de luz a qual estamos habitualmente
acostumados. O princípio de funcionamento do MEV consiste na emissão de feixes
de elétrons por um filamento capilar de tungstênio (eletrodo negativo),
mediante a aplicação de uma diferença de potencial que pode variar de 0,5 a 30
KV. Essa variação de voltagem permite a variação da aceleração dos elétrons, e
também provoca o aquecimento do filamento. A parte positiva em relação ao
filamento do microscópio (eletrodo positivo) atrai fortemente os elétrons
gerados, resultando numa aceleração em direção ao eletrodo positivo. A correção
do percurso dos feixes é realizada pelas lentes condensadoras que alinham os
feixes em direção à abertura da objetiva. A objetiva ajusta o foco dos feixes
de elétrons antes dos elétrons atingirem a amostra analisada.
Amostras condutoras não exigem nenhuma preparação especial.
Toda via amostras isolantes devem ser cobertos com uma camada de material
condutivo, exceto quando observados com Ambiente de Vácuo Variável. Uma
cobertura ultrafina de material eletricamente condutiva é depositada tanto por
evaporação de alto vácuo quanto por sputter de baixo vácuo na amostra. Isto é
feito para prevenir a acumulação de campos elétricos estáticos no espécime
devido irradiação elétrica durante a produção da imagem. Tais coberturas
incluem ouro, ouro/paládio, platina, tungstênio, grafite, etc. Outra razão para
a metalização, mesmo quando há condução mais do que suficiente, é para melhorar
o contraste, está situação é mais comum na operação de microscópios eletrônicos
de varredura por emissão de campo (field emission SEM).
Embutindo em uma resina e polimento com acabamento espelhado
pode ser benéfico para ambas amostras, tanto biológicas quanto materiais,
especialmente quando imagens por elétrons retro espalhados (backscatterd) ou
microanálises por raios X são feitas.
Uma amostra biológica necessita fixação para preservar sua
estrutura, que é usualmente feita com a incubação da amostra em solução fixadora,
como glutaraldeído ou formaldeído.
Se não usada em ESEM, amostras biológicas devem ser
desidratadas, usualmente substituindo água por solventes orgânicos como etanol
ou acetona, e então removendo os solventes.
Se o MEV for equipado com cryo-microscopia, então
cryofixação pode ser usada. Cryofixação - congelando o espécime tão rápido, à
temperaturas de nitrogenio líquido ou mesmo hélio líquido, que a água forma de
gelo vítreo (não cristalino). Isto preserva o espécime em uma tomada de seu
estado dissolvido. Um campo inteiro chamado microscopia cryo-electrônica
ramificou a partir desta técnica. Com o desenvolvimento da microscopia
cryo-eletrônica de seções vítreas, é agora possível observar virtualmente
qualquer amostra biológica próximo de seu estado nativo.
Outra cryo-técnica para amostras biológicas é a
cryo-fratura, quando a amostra congelada é fraturadoa com uma aparato especial,
metalizada e trasnferida para o cryo-holder enquanto permance congelada.
Data a falta de informação, metalização com ouro é até um
processo semi-destrutiva desde que remover a camada de ouro quimicamente requer
químicos agressivos como cianeto de potássio ou áqua régia.
Técnicas alternativas, por exemplo baixo vácuo MEV
ambiental, permite a visualização de amostras sem metalização e sem a perda do
contraste natural vindo da interação feixe-amostra. Ouro tem um alto número
atômico e produz alto contraste topográfico e resolução mas a informação uma
vez produzida pode ficar obscura e esconder detalhes finos da amostra sendo examinada.
Trabalhando com elétrons de baixa energia (na faixa de 1
keV), um microscópio eletrônico de varredura a baixa voltagem, recentemente
desenvolvido, dispensa a etapa de metalização da amostra e permite a observação
direta da estrutura lamelar de polímeros semicristalinos, sem a necessidade de
preparação da amostra, podendo a estrutura superficial do polímero ser
investigada diretamente em alta resolução. Para a obtenção dos melhores tem-se
trabalhado com amostras na forma de filmes semi-finos (espessuras na faixa de
mm), dado que, para este caso, o recobrimento para condutividade elétrica pode
ser dispensado, oferecendo acesso direto à superfície original da amostra.
Outra vantagem é a facilidade com que uma determinada região de interesse na
amostra pode ser selecionada e localizada em baixo ampliação. Desta maneira,
por exemplo, esferulitos podem ser fotografados primordialmente num microscópio
ótico, e identificados posteriormente no microscópio eletrônico para um estudo
mais detalhado de sua estrutura lamelar.
Aonde usar um MEV no Brasil
Se houver o envio de proposta de pesquisa o LNLS, é possível realização de imagens de alta resolução assim como detecção espectral da composição da amostra a ser analisada.
Leia mais em http://pt.wikipedia.org/wiki/Microsc%C3%B3pio_eletr%C3%B4nico_de_varredura
http://www.lnls.br/
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